Оглавление.

Введение………………………………………………………………………………...4

1. Обзор литературы. Прионные наследственные детерминанты
дрожжей Saccharomyces cerevisiae…………...…………………..…………..……6

1.1 Наследственные детерминанты [PSII] и [URE3]…………..…..…………6

1.2 Критерии Викнера……………………………………………………………..7

1.3 Особенности структуры белков Sup35 и Ure2. Прионные домены…………………………………………………………………………...….9

1.4 Влияние мутаций в соответствующих структурных генах
на процесс прионообразования………………………………………………..11

1.5 Механизм прионизации……………………………………………………..12

1.6 Образование прионами агрегатов…………………………….………….12

1.7 Влияние шаперонов на прионные детерминанты………………….…..13

1.8 Другие белки, влияющие на прионы……………………..………….……15

1.9 Поиск новых прионных детерминант…………..…………………………16

1.10 Прионный наследственный детерминант [PIN]……………………….17

1.11 Прионоподобный детерминант [ISP⁺]……………………………….….18

2. Материалы и методы……………………………………..……………………...21

2.1 Штаммы……………………………………………………………………….21

2.2 Плазмиды……………………………………………………………………..21

2.3 Среды и условия культивирования………………………………………23

2.4 Генетические методы……………………………………………………….23

2.5 Молекулярно-генетические методы………………………………………23

3. Результаты и обсуждение………………………………………………...……..26

3.1 Трансформация штамма 25-25-2В-П3982 [ISP⁺]
инсерционным банком генов……………………………………………....…..26

3.2 Идентификация и анализ трансформантов,
потерявших детерминант [ISP⁺]……………………………………………….27

3.3 Идентификация точки инсерции минитранспозона mTn3……………33

3.4 Секвенирование плазмид p1 и p5,
и анализ полученных результатов……………………………………………38

3.5 Секвенирование плазмид p51 и p52,
и  анализ полученных результатов……………………………………………40

4. Выводы ……………………………………………………..………………………42

5. Список литературы………………………………………..………………………42

Введение.

Одним из важнейших событий, произошедших в биологии в последние годы, является появление прионной концепции. Прионы были открыты как инфекционные агенты некоторых нейродегенеративных заболеваний млекопитающих. Оказалось, что эти болезни вызывает белок PrP, находящийся в особом состоянии, в котором белок способен катализировать конформационный переход нормальных молекул в прионизованное состояние. Такие белки были названы прионами от “proteinaceous infectious (particles)” - “белковая инфекционная (частица)”.

Значение открытия прионов стало еще более очевидным, когда было показано, что сходные по своей молекулярной природе превращения могут претерпевать некоторые белки модельного генетического объекта – дрожжей сахаромицетов. В этом случае также существует особая форма белка, способная индуцировать конформационное превращение нормальных молекул белка. Следует отметить существенное отличие прионов дрожжей от прионов млекопитающих: прионы дрожжей наследуются как цитоплазматические детерминанты. Таким образом произошло открытие нового типа наследования, основанного на копировании конформации белковой молекулы.

На сегодняшний день у дрожжей Saccharomyces cerevisiae идентифицированы три наследственных детерминанта, имеющих прионную природу: [PSI⁺], [URE3] и [PIN]. Кроме того, некоторые свойства других белков дрожжей указывают на возможность их прионного превращения. Важным вопросом теории прионной наследственности является взаимодействие прионов, поскольку присутствие одних прионов влияет на появление и поддержание других прионов. Возможно, все клеточные прионы можно рассматривать как единую взаимодействующую прионную “сеть”.

Актуальной задачей современной генетики является идентификация и описание новых прионов. Это важно для определения степени распространения феномена прионного превращения белков и выяснения закономерностей этого процесса. Кроме того, изучение связи новых прионов с уже известными  прионами может подтвердить или опровергнуть гипотезу существования в клетке единой прионной сети. 

В нашей лаборатории обнаружен наследственный детерминант [ISP⁺], который обладает прионными свойствами. Следующим шагом в характеристике [ISP⁺], должна стать идентификация гена, кодирующего белок, прионной формой которого, возможно, является [ISP⁺]. Один из методов идентификации этого гена основан на трансформации штаммов дрожжей инсерционным банком генов.

Настоящая работа посвящена поиску структурного гена детерминанта [ISP⁺] и других генов, влияющих на его поддержание.

Обзор литературы.

Прионные наследственные детерминанты дрожжей Saccharomyces

cerevisiae.

Наследственные детерминанты [PSII] и [URE3].

Первые наследственные детерминанты дрожжей Saccharomyces cerevisiae, для которых была показана прионная природа – это [PSI⁺]  и [URE3].

Неменделевски наследуемый детерминант [PSI⁺] был обнаружен в 1965г. Б.Коксом (Cox, 1965). Первоначально обнаруженное проявление [PSI⁺] было связано с усилением в его присутствии эффективности слабых супрессорных тРНК (Cox, 1971), однако позже было показано, что [PSI⁺] приводит к омнипотентному нонсенс-супрессорному эффекту и в отсутствии мутантных тРНК (Cox et al., 1988; Liebman et al. 1979).

[PSI⁺] локализуется в цитоплазме, что было доказано отсутствием регулярного расщепления по эффекту супрессии в мейозе и возможностью его переноса при цитодукции (Cox et al., 1988). Существенная особенность фактора [PSI⁺] состоит в доминировании [PSI⁺]-состояния штамма над [psi^-], что проявляется при скрещивании [PSI⁺] и [psi^-] штаммов (Cox, 1965; Cox et al., 1988).

Одним из характерных свойств фактора [PSI⁺] является возможность его элиминации под воздействием некоторых агентов, наиболее эффективным из которых является гидрохлорид гуанидина (GuHCl) (Tuite et al. 1981). Это вещество при высоких концентрациях вызывает денатурацию белков, однако элиминация [PSI⁺]  происходит на средах с очень низкой концентрацией GuHCl (1-5мМ). Полученные таким образом [psi^-] клоны обычно стабильны. В течение некоторого времени считалось, что они вообще не способны ревертировать к [PSI⁺]–состоянию (Land and Cox, 1981; Cox et al., 1988), однако затем были обнаружены случаи повторного возникновения [PSI⁺] (Тиходеев и др., 1990).

Была показана зависимость индукции и поддержания детерминанта [PSI⁺] от ядерного гена SUP35, кодирующего фактор терминации трансляции eRF3. Было обнаружено, что сверхэкспрессия гена SUP35 приводит к индукции фактора [PSI⁺] (Chernoff et al., 1993). При этом дизрупция N-терминальной части гена SUP35 приводит к элиминации и невозможности образования детерминанта [PSI⁺] (Ter-Avanesyan et al., 1994).

Сходные свойства были обнаружены у другого наследственного детерминанта [URE3], который был описан в 1971 году Ф.Лакру (Lacroute, 1971). Клетки, содержащие детерминант [URE3], могут поглощать уреидосукцинат в присутствии более богатых источников азота, в то время как клетки дикого типа не способны к этому.

Так же, как и [PSI⁺], [URE3] проявляет нерегулярное расщепление в мейозе, передается при цитодукции и может быть элиминирован при пассировании дрожжевых клеток на среде, содержащей GuHCl, при этом элиминация [URE3] обратима (см. Wickner et al., 1996). Поддержание [URE3] зависит от хромосомного гена URE2, кодирующего негативный транскрипционный регулятор азотного метаболизма. Было показано, что поддержание [URE3] невозможно в отсутствии гена URE2, а сверхэкспрессия этого гена приводит к 50-100-кратному увеличению частоты индукции [URE3] (Wickner, 1994).

Физическая природа детерминантов [PSI⁺] и [URE3] долгое время оставалась неизвестной. Попытки связать эти детерминанты с какой-либо экстрахромосомной нуклеиновой кислотой имели отрицательный результат (Young and Cox, 1972; Tuite et al., 1982; Cox et al., 1988; McCready and McLaughlin, 1977; Garvik and Haber, 1978; Aigle and Lacroute, 1975).    

Гипотеза, объясняющая природу [PSI⁺] и [URE3] была высказана Р.Викнером в 1994г (Wickner, 1994). Викнер первым обратил внимание на то, что поведение обоих детеминантов может быть объяснено в рамках прионной модели. Согласно этой гипотезе [PSI⁺] и [URE3] представляют собой прионные конформационные изомеры белков, кодируемых генами SUP35 и URE2, соответственно. Такое предположение прекрасно объясняло все свойства этих детерминантов, что не удавалось сделать в рамках классической генетики.

Критерии Викнера.

Викнер сформулировал следующие критерии, благодаря которым можно отличить прионные наследственные детерминанты от нуклеиновых репликонов, таких как вирусы и плазмиды (Wickner, 1994).  

1. Обратимая излечиваемость.

Под воздействием некоторых агентов возможно излечивание клеток от прионных детерминантов, что приводит к отсутствию прионных форм белка. Однако даже в “излеченных” клетках возможно повторное появление прионных детерминантов: спонтанное нарушение в укладке белка, приводящее к появлению альтернативных конформационных изомеров, в частности может привести к образованию прионной формы белка.

2. Появление приона индуцируется сверхпродукцией белка.

В результате сверхпродукции белка появляется больше молекул, которые могут спонтанно перйти в прионную форму. Это увеличивает частоту, с которой прион появляется спонтанно.

3. Для поддержания приона необходимо присутствие нормального белка.

Появление прионных изомеров происходит путем изменения укладки  нормальной формы белка. Таким образом, в процессе прионизации нормальная форма белка является субстратом, и в его отсутствие пополнение пула прионных молекул невозможно. В ряду клеточных  поколений отсутствие нормального белка приводит к потере прионных наследственных детерминант.

4. Одинаковый фенотип клеток как в присутствии приона, так и в присутствии мутации в гене, кодирующем соответствующий белок.

Присутствие приона и мутация в соответствующем гене приводят к нарушению функциональной активности белка. В первом случае белок синтезируется, однако, он инактивируется переходом в прионную форму. Во втором случае белок вообще не синтезируется или синтезируется его неактивная форма. Таким образом, как при появлении мутации в гене, так и при появлении соответствующего приона происходит инактивация белка, что приводит к одинаковому или сходному фенотипу.

Эти критерии, предложенные в 1994 году, до сих пор являются основой для доказательства прионной природы наследственных детерминантов. Однако следует отметить, что некоторые факты, ставшие известными в результате последующих исследований прионной наследственности, не вписываются в эти критерии и требуют внесения в них дополнений.

Особенности структуры белков Sup35 и Ure2. Прионные домены.

Сравнение последовательности белков, способных к прионным превращениям, выявило ряд закономерностей в их первичной структуре.

Рассмотрим более подробно данные, касающиеся структуры белка Sup35p.

Секвенирование гена SUP35 показало, что он представляет собой открытую рамку считывания, способную кодировать белок, состоящий из 685 аминокислотных остатков и имеющий молекулярную массу в 76,5 кДа (Kushnirov et al., 1988). Анализ аминокислотной последовательности белка показал, что белок Sup35p содержит три района, обозначенные как N (с 1 по 123 аминокислоту) M (со 124 по 253 аминокислоту) и C (с 254 по 685 аминокислоту), существенно различающиеся по своей структуре (Kushnirov et al., 1988).

Делеционный анализ гена SUP35 совместно с другими методами позволил определить функциональное значение доменов белка Sup35p. Было показано, что C-домен является жизненно важным для клеток и необходим в процессе терминации трансляции. Домены N и M можно делетировать, при этом жизнеспособность клеток не изменяется (Ter-Avanesyan et al., 1993). На сегодняшний день известна только одна функциональная роль N домена. Было показано, что первые 114 аминокислот N-домена Sup35p определяют прионное превращение этого белка. Так, делеция N-домена белка Sup35p в гаплоидном [PSI⁺]-штамме приводит к элиминации [PSI⁺] (Ter-Avanesyan et al., 1994), а сверхэкспрессия укороченной с 3’ конца аллели SUP35 вызывает индукцию фактора [PSI⁺] (Chernoff et al., 1993; Derkatch et al., 1996). Домен М, возможно, обеспечивает взаимодействие Sup35p и Sup45p (Paushkin et al., 1997a), хотя окончательно это пока не доказано.

Анализ аминокислотной последовательности белка Sup35p показал, что его N-домен обогащен глутамином, аспарагином, глицином и тирозином, при этом в нем присутствуют пять тандемных несовершенных повторов последовательности QGGYQ(Q)QYNP (Kushnirov et al., 1988; Кушниров и др., 1995). Значимость этих повторов была продемонстрирована Линдквист и Ли. Было показано, что увеличение количества олигопептидных повторов приводит к повышению частоты индукции [PSI⁺] (Liu and Lindquist, 1999). Также было показано, что N-домен Sup35p может быть замещен на полиглутаминовый олигопептид без снижения способности к поддержанию [PSI⁺] (DePace et al., 1998).

Белок Ure2p, состоящий из 354 аминокислотных остатков, так же как Sup35p, можно подразделить на N- и C-терминальные домены (с 1 по 65 аминокислоту и с 66 по 354 соответственно) (Fernandez-Bellot et al., 1999). С-терминальная часть обеспечивает функционирование белка Ure2p как негативного транскрипционного регулятора генов, продукты которых участвуют в утилизации “бедных” источников азота. N-терминальная часть, также как и в случае Sup35p, необходима для поддержания [URE3], а также обеспечивает его индукцию при сверхэкспрессии этого домена (Masison and Wickner, 1995). Аминокислотный анализ белка Ure2p показал, что район, включающий в себя 1-80 аминокислоты, содержит аспарагин-богатый участок, где содержание аспарагина составляет около 40% (Fernandez-Bellot et al., 1999).

Участок с 1 по 65 аминокислоту белка Ure2p был идентифицирован как минимальный участок, сверхэкспрессия которого приводит к индукции [URE3], и присутствие которого необходимо для прионной конверсии Ure2p (Masison and Wickner, 1995; Masison et al., 1997). Однако в дальнейшем было идентифицировано еще два участка  Ure2p (с 66 по 80 и с 221 по 227 аминокислоту), которые обладают прионогенной активностью (Masison et al., 1997; Maddelein and Wickner, 1999; Fernandez-Bellot et al., 1999; Fernandez-Bellot et al., 2000).

Таким образом в белках Ure2p и Sup35p были выявлены прионогенные домены, ответственные за поддержание и индукцию соответствующих прионных детерминант, которые имеют сходные особенности в строении. Так прионогенные домены белков Ure2p и Sup35p на 40-50% состоят из остатков аспарагана и глутамина и практически не содержат заряженных аминокислот. Решающая роль в прионной конверсии аспарагин-глутамин богатых участков подтверждена и другими данными (Michelitsch and Weissman, 2000). На сегодняшний день этими свойствами обладают прионогенные домены всех известных прионов.

Влияние мутаций в соответствующих структурных генах на процесс прионообразования.

Мутации в генах, кодирующих прионные белки, могут влиять как на способность поддержания, так и на частоту индукции приона в клетке. 

Ряд мутаций в структурных генах прионов приводят к нарушениям в процессе укладки новосинтезированного белка. Это может приводить к увеличению частоты появления неправильно сложенных белков и, следовательно, к увеличению частоты спонтанного появления прионной конформации белка (Prusiner and Scott, 1997).

Разными авторами получены мутации, предотвращающие прионные превращения белка. Точечные мутации или частичные делеции в области N-доменов Sup35p и Ure2p, как правило, приводят к тому, что эти белки не могут претерпевать прионные конформационные превращения. Чаще всего эти мутации являются рецессивными: в гетерозиготных по таким мутациям штаммах возможно присутствие прионных детерминант, однако их фенотипическое проявление маскируется. Это объясняется возможностью образования и поддержания приона за счет нормальной аллели, однако фенотипически это не проявляется, так как в клетке есть мутантные белки, которые не претерпевают прионных превращений, но могут выполнять свои нормальные клеточные функции.

Однако наряду с рецессивными мутациями, были обнаружены и доминантные мутации, приводящие к потере прионных детерминант. К ним относятся мутации PNM (от [PSI⁺] no more). Картирование этих мутаций показало, что они касаются N-домена Sup35p. Так, мутация PNM2 представляет собой замену глицина на аспарагин в 58-м положении N-домена (Doel et al., 1994). Другие мутации PNM были локализованы в районе с 8 по 24 аминокислоту, и в большинстве случаев представляли собой замены глутаминовых или аспарагиновых остатков на аргинин (DePace et al., 1998). В гибридах [PSI⁺], гетерозиготных по доминантным PNM мутациям, в течение нескольких клеточных делений при нормальных условиях культивирования происходит элиминация фактора [PSI⁺] (Young and Cox, 1971; McReady and Cox, 1973; Cox et al., 1980). Механизм проявления некоторых PNM мутаций связан с нарушением взаимодействия мутантного Sup35p с белком Sla1 (см. раздел “другие белки, влияющие на прионы”) (Bailleul et al., 1999).

Механизм прионизации.

Механизм, посредством которого в клетках осуществляется конверсия нормальных форм белка в прионизованные, на сегодняшний день точно не известен. Для объяснения этого процесса предложено две модели: гетеродимерная и полимеризационная модель.

Согласно гетеродимерной модели (Prusiner, 1989; Prusiner, 1991) белок в прионной конформации является более стабильным по сравнению с нормальной изоформой белка, однако переход в прионизованное состояние затруднен по энергетическим причинам. В этом случае прион при взаимодействии с нормальным белком может катализировать его прионное превращение.

В соответствии с полимеризационной моделью (Gajdusek, 1988) прионизацию можно уподобить процессу кристаллизации. Эта модель предполагает, что переход между прионной и нормальной изоформами белка носит обратимый характер. Нормальная изоформа белка более стабильна, чем мономерная форма приона, однако при взаимодействии с другими прионными молекулами происходит их стабилизация. Лимитирующей стадией полимеризации, в соответствии с этой моделью, является образование “ядра кристаллизации”.

Ряд данных, полученных при изучении прионов, подтверждают полимеризационную модель прионизации. Одним из них является образование всеми известными прионами агрегатов, которые, по-видимому, стабилизируют прионные изоформы белков.

Образование прионами агрегатов.

Для прионов млекопитающих свойственно образование агрегатов (см. Prusiner, 1996). В ходе биохимических исследований было показано, что прионы низших эукариот обладают таким же свойством.

Многочисленные эксперименты показали, что клетки [PSI⁺] и [URE3] содержат высокомолекулярные агрегаты белка Sup35p и Ure2p соответственно, в то время как в [psi^-] и [ure3] клетках такие агрегаты не обнаруживаются (Paushkin et al., 1996; Patino et al., 1996; Edskes et al., 1999). Это говорит о том, что агрегаты образуются из белков находящихся в прионной конформации. Интересной особенностью этих агрегатов является повышенная протеазоустойчивость (Masison and Wickner, 1995; Paushkin et al., 1996), которая также свойственна агрегатам прионов млекопитающих (Oesch et al., 1985).

Образование в клетке прионных агрегатов было визуализировано с помощью гибридных белков. Оказалось, что если методами генной инженерии к прионогенному домену Sup35p или Ure2p пришить другой белок, способность белка к прионизации часто сохраняется. В частности, прионогенные домены можно соединить с белком GFP (Green Fluorescens Protein) и с помощью флуоресцентного микроскопа идентифицировать локализацию этого белка. Было показано, что в клетках, несущих прионные детерминанты [PSI⁺] и [URE3], соответствующие химерные белки включаются в фибриллярные, зернистые или кольцеобразные агрегаты. В клетках, излеченных от прионов таких агрегатов не наблюдается (Edskes et al., 1999; Patino et al., 1996).

Образование фибриллярных структур было показано рядом экспериментов и в системе in vitro. В частности, очищенные N-домены Sup35p и Ure2p, а также полноразмерный Sup35p, способны образовывать in vitro фибриллярные структуры (Paushkin et al., 1997a; King et al., 1997; Glover et al., 1997; Tailor et al., 1999). При этом белки, входящие в состав фибрилл, имеют β-складчатую структуру, характерную для прионных изоформ белка PrP млекопитающих (Pan et al., 1993).

Образование агрегатов представляется важным процессом в прионизации. Как уже упоминалось, конформационное изменение нормальных форм белка, возможно, происходит именно при взаимодействии с агрегатами прионов.

Влияние шаперонов на прионные детерминанты.

При исследовании прионных наследственных детерминантов была обнаружена их зависимость от белков-шаперонов.

В частности, была показана зависимость прионных детерминант от шаперона Hsp104p. Основная функция этого белка состоит в разрушении образующихся при стрессовых условиях агрегатов частично денатурированных белков (см. Chernoff, 2001).

Зависимость детерминанта [PSI⁺] от шаперона Hsp104p носит парадоксальный характер: как сверхпродукция так и полное отсутствие этого белка приводит к элиминации [PSI⁺] (Chernoff et al., 1995; см. Wickner, 1995). При этом агрегация Sup35p зависит от уровня экспрессии Hsp104p таким же образом: агрегаты Sup35p не обнаруживаются при отсутствии Hsp104p и при его сверхэкспрессии (Paushkin et al., 1996; Patino et al., 1996). Следует отметить, что критичность уровня экспрессии Hsp104p для поддержания [PSI⁺] подтверждает белковую природу этого детерминанта.

Было предложено две модели, объясняющие действие Hsp104p на [PSI⁺] (см. Chernoff, 2001). Наиболее убедительной на сегодняшний день представляется модель, согласно которой Hsp104p действует на агрегаты Sup35p так же как на агрегаты других белков, т.е. расщепляет их. Это легко объясняет, почему сверхэкспрессия Hsp104p приводит к элиминации [PSI⁺]: в этом случае разрезание идет очень эффективно и в клетках практически не остается олигомеров, которые могли бы служить затравкой для образования агрегатов. В случае отсутствия этого шаперона по-видимому в клетках накапливаются очень большие агрегаты, распределение которых между дочерними клетками затруднено (Paushkin et al., 1996; Kushnirov and Ter-Avanesyan, 1998). 

Элиминация [PSI⁺], происходящая под воздействием некоторых агентов, возможно, связана с изменением уровня Hsp104p (Chernoff et al., 1995). Это подтверждается тем, что экспрессия Hsp104p индуцируется при тепловом шоке, осмотическом стрессе и при действии этанола (Sanchez et al., 1992). Под воздействием GuHCl, вещества, которое наиболее эффективно изгоняет прионные детерминанты, также увеличивается уровень Hsp104p (Lindquist et al., 1995; Chernoff et al., 1995). Однако кажется маловероятным, что эффект GuHCl на [PSI⁺] объясняется индукцией Hsp104p, поскольку сверхпродукция Hsp104p действует довольно быстро (Patino et al., 1996), а эффект GuHCl зависит от количества клеточных генераций (Eaglestone et al., 2000). Кроме того, было показано, что GuHCl в низкой концентрации ингибирует АТФазную активность Hsp104p (Glover et al., 1998). Поэтому, несмотря на увеличение уровня Hsp104p под воздействием GuHCl, его активность вряд ли увеличивается.

Детерминант [URE3], как и [PSI⁺], зависит от шаперона Hsp104p. Однако в этом случае инактивация Hsp104p приводит к потере [URE3] в некоторых штаммах, но не во всех, а сверхэкспрессия Hsp104p не приводит элиминации приона (см. Liebman and Derkatch, 1999).

Исследования показали, что на прионные детерминанты влияют также шапероны, относящиеся к семейству Hsp70. У дрожжей основным подсемейством Hsp70 является семейство Ssa, включающее в себя высокогомологичные белки Ssa1, 2, 3, и 4 (Werner-Washburne et al., 1987). Уровень Ssa белков, так же как уровень Hsp104p, увеличивается под воздействием стрессовых условий, причем показано, что Ssa1 вместе с Hsp104p участвует в процессе разрушения агрегатов и переукладке денатурированых белков (Glover et al., 1998). Однако сверхэкспрессия Ssa1, в отличии от Hsp104p, приводит к увеличению супрессии, вызванной [PSI⁺], и, более того, предотвращает “излечивание” [PSI⁺] под воздействием сверхпродукции Hsp104p (Chernoff et al., 1999).

Белки, принадлежащие к другому подсемейству Hsp70, Ssb, конститутивно экспрессируется в клетке. Ssb белки ассоциированы с рибосомами и обеспечивают идентификацию неправильно сложенных белков и их разрушение. В лаборатории Ю.О. Чернова было показано, что увеличение уровня Ssb ускоряет элиминацию [PSI⁺] в отсутствие Hsp104p. Дизрупция генов SSB приводит к уменьшению эффективности элиминации [PSI⁺] в отсутствие Hsp104p и значительно увеличивает частоту спонтанного появления [PSI⁺] (Chernoff et al., 1999).

Действие белков семейства Hsp70 на другие прионы пока не изучено. 

Другие белки, влияющие на прионы.

Кроме шаперонов были идентифицированы другие белки, влияющие на прионы дрожжей.

На поддержание детерминанта [PSI⁺] влияет белок Sla1, который участвует в образовании микрофиламентов актина цитоскелета (Holtzman et al., 1993). С помощью двугибридного скрининга было показано, что C-терминальный домен Sla1 взаимодействует с N-терминальным (прионогенным) доменом Sup35p, причем это взаимодействие ингибируется инактивацией Hsp104p. Следует отметить, что некоторые PNM мутации (см. “влияние мутаций в соответствующих структурных генах на процесс прионообразования”), приводят к нарушению эффективного взаимодействия Sup35p и Sla1. В [psi^-] штаммах, несущих делецию гена SLA1, частота индукции [PSI⁺] под воздействием сверхэкспрессии Sup35p значительно снижена, в отличие от штаммов, несущих полноразмерную аллель гена SLA1. Кроме того, в штаммах sla1D наблюдается увеличение эффективности элиминации [PSI⁺] под воздействием сверхпродукции Hsp104p (Bailleul et al., 1999).

Таким образом, белок Sla1, связываясь с Sup35p, является активатором его прионизации. Механизм влияния белка Sla1 на [PSI⁺] пока остается не совсем понятным.

Эффективность индукции [PSI⁺] также сильно зависит от уровня другого фактора терминации трансляции, Sup45p (eRF1). Увеличение уровня этого белка приводит к снижению нонсенс-супрессии (Stanfield et al., 1995) и частоты образования [PSI⁺] (Derkatch et al., 1998) при сверхэкспрессии Sup35p. По-видимому, физическое взаимодействие Sup45p с Sup35p (Paushkin et al., 1997b) препятствует переходу Sup35p в прионное состояние и его агрегации. Интересно, что уровень Sup45p влияет на индукцию, но не на поддержание [PSI⁺] (Derkatch et al., 1998). Более того, в некоторых случаях было показано, что в [PSI⁺] штаммах происходит включение молекул Sup45p в агрегаты Sup35p (Paushkin et al., 1997b).

На индукцию детермианта [URE3] влияет белок Mks1, который является негативным посттранскрипционным регулятором активности Ure2, и, по-видимому, непосредственно с ним взаимодействует. Отсутствие белка Mks1 приводит к невозможности индукции [URE3]. При этом так же, как и в случае [PSI⁺] и Sup45p, поддержание [URE3] не зависят от Mks1 (Edskes and Wickner, 2000).

Поиск новых прионных детерминант.

В настоящее время актуальной задачей является поиск и исследование новых прионов.

Один из способов выявления возможных прионов - это поиск белков с последовательностями, гомологичными известным прионным доменам, которые обогащены глутамином и аспарагином (Michelitsch and Weissman, 2000). Показано, что 108 белков S. cerevisiae, что составляет около 2% протеома, соответствуют этому критерию. Сложно сказать, какая часть из этих белков является прионами, однако уже показано, что 11 из них, при увеличении их количества в клетках дрожжей, вызывают появление прионного детерминанта [PIN⁺] (см. ниже) (Derkatch et.al., 2001). Для двух белков, которые имеют участки гомологичные известным прионным доменам, Rnq1 и New1, достоверно показано их существование в прионной форме (Sondheimer and Lindquist, 2000; Santoso et al., 2000).

Другой подход связан с поиском новых наследственных детерминантов прионной природы.

Прионный наследственный детерминант [PIN].

Прионный наследственный детерминант [PIN] был обнаружен в процессе изучения [PSI⁺]. Оказалось, что [PSI⁺] может возникать de novo не во всех штаммах, причем возможность появления [PSI⁺] определяется присутствием наследственного детерминанта, который был назван [PIN] от “[PSI⁺] inducibility”. Изучение свойств этого детерминанта показало, что он необходим для образования [PSI⁺], однако поддержание [PSI⁺] от него не зависит. Было показано, что [PIN] наследуется через цитоплазму, зависит от Hsp104p, изгоняется при выращивании клеток на среде с 5мМ концентрацией GuHCl, причем после этого возможно его повторное появление. Эти данные позволили предположить прионную природу [PIN] (Derkatch et.al., 2000).

Исследования показали, что детерминант [PIN] является прионной формой белка Rnq1. Так, индукция [PIN] сопровождается появлением агрегатов Rnq1, а дизрупция RNQ1 приводит к невозможности появления и поддержания этого детерминанта. Однако было показано, что детерминант [PIN] может появляться в результате прионизации еще двух белков: Ure2p и New1. Кроме этого, было идентифицировано девять других белков, сверхэкспрессия которых снимает зависимость появления [PSI⁺] от детерминанта [PIN] (Derkatch et.al., 2001).

На сегодняшний день известно, что возможность индукции [PSI⁺] определяется присутствием прионных агрегатов [PIN]. Рассматривается два возможных варианта действия [PIN] на [PSI⁺]. Согласно “титрационной модели” в клетке присутствует ингибитор прионизации Sup35p, однако [PIN] агрегаты способны его связывать, в результате чего обеспечивают возможность появления [PSI⁺]. В соответствие с “моделью затравки”, прионизация Sup35p не возможна без взаимодействия этого белка с прионными агрегатами [PSI⁺] или [PIN]. Таким образом в [psi^-] штаммах прионные агрегаты [PIN] играют роль затравки для прионизации Sup35p (Derkatch et.al., 2001).

Прионоподобный детерминант [ISP⁺].

В нашей лаборатории при скрининге коллекции дрожжевых мутантов по гену SUP35, был обнаружен еще один детерминант, обладающий прионными свойствами (Volkov et al., 2002). Фенотипически этот детерминант, обозначенный [ISP⁺], проявляется как антисупрессор супрессорных мутаций sup35-25 и sup35-10. Исследование его свойств показало, что он

· элиминируется после пассирования клеток на среде с хлоридом гуанидина,

· доминантен по отношению к [isp^-],

· неменделевски наследуется в мейозе,

· передаётся при цитодукции, 

· возникает вновь после изгнания с помощью GuHCl с частотой 10^-4 на клетку на генерацию (Volkov et al., 2002).

Эти данные позволили предположить прионную природу [ISP⁺]. Поскольку фенотипическое проявление [ISP⁺] связано с геном SUP35, изначально рассматривалась возможность, что этот детерминант является разновидностью прионного детерминанта [PSI⁺]. Однако сегодня эта гипотеза отвергнута, т.к. [ISP⁺] обладает рядом свойств, отличных от свойств [PSI⁺]. Показано, что при сверхэкспресси аллелей sup35-25 и sup35-10 не происходит изменения в частоте возникновения [ISP ⁺], кроме того, [ISP ⁺] может поддерживаться в отсутствие N-домена Sup35p, который ответственен за прионное превращение этого белка. Также показано, что, в отличие от известных на сегодняшний день прионов, шаперон Hsp104 не оказывает влияния на поддержание [ISP⁺]. На основании этих данных [ISP⁺] рассматривается как новый прионоподобный детерминант, вовлеченный в контроль точности терминации трансляции у дрожжей (Volkov et al., 2002).

Следующим шагом в характеристике [ISP⁺], должна стать идентификация гена, кодирующего белок, прионной формой которого, возможно, является [ISP⁺]. Один из методов, который может быть использован для идентификации этого гена, основан на трансформации штаммов дрожжей инсерционным банком генов. Этот банк состоит из бактериальных плазмид, несущих разные участки генома дрожжей, причём открытые рамки считывания, содержащиеся в этих участках, разрушены минитранспозоном (Burns et al., 1994). Трансформация клеток дрожжей линеаризованным инсерционным банком приводит к тому, что минитранспозоны, фланкированные последовательностями дрожжевой ДНК, интегрируются в геном по механизму гомологичной рекомбинации. Следствием рекомбинации будет инактивация соответствующих генов из-за инсерции транспозона. Таким образом, может быть инактивирован и ген, кодирующий детерминант [ISP⁺].

К сожалению, не представляется возможным предсказать заранее, к какому фенотипу приведёт инактивация гена, кодирующего детерминант [ISP⁺]. Можно представить два возможных варианта: с одной стороны инактивация гена ISP может не иметь собственного фенотипического эффекта. Точно так же, как удаление части гена, кодирующего прионогенный домен Sup35p не приводит к изменению фенотипа [psi^-]-штамма (Ter-Avanesyan et al., 1994). С другой стороны, инактивация гена ISP может приводить к антисупрессорному эффекту, то есть к такому же эффекту, как присутствие детерминанта [ISP⁺]. Такого рода ситуация характерна для системы ген URE2-детерминант [URE3]. Наличие [URE3] приводит к тому, что клетка начинает поглощать уреидосукцинат в присутствии богатых источников азота. В то же время делеция гена URE2 также приводит к тому же фенотипу. То есть как инактивация самого гена, так и инактивация его продукта из-за прионного превращения приводит к одинаковому фенотипу. Следует отметить, что в любом случае при дизрупции структурного гена ISP должна происходить потеря детерминанта [ISP⁺].

Мы использовали систему селекции, позволяющую проверить первый из возможных фенотипических эффектов дизрупции гена ISP. Если предполагать, что дизрупция гена ISP не приводит к собственному фенотипическому эффекту, а ведёт только к исчезновению [ISP⁺], то эта дизрупция должна приводить к тому, что исходный штамм ISP sup35-25 [ISP⁺], не супрессирующий нонсенс мутации his7-1 и lys2-87, теряет детерминант [ISP⁺] (ISP :: mTn sup35-25 [isp^-]) и соответственно супрессирует мутации his7-1 и lys2-87. Таким образом, появление супрессорных трансформантов может свидетельствовать о дизрупции у них гена ISP или генов, влияющих на поддержание [ISP⁺].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Штаммы.

В работе использовали штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae Петергофских генетических линий (ПГЛ). Генотипы штаммов приведены в таблице 1.

Таблица 1. Штаммы, использованные в работе.
Штамм	Генотип
5Б-П4513	МАТa  ade1-14 his7-1 lys2-87 ura3D  leu2-1 met13-A1 sup35-25 [ISP^+] и [isp^-]
25-25-2В-П3982*	МАТa ade1-14 his7-1 lys2-87 ura3D leu2-1 thr4-B15 sup35-25 [ISP^+] и [isp^-]
2Г-П2345	МАТa his5
78А-П2345	МАТa his5
Примечания. При обозначении генотипов использованы традиционные обозначения мутаций ауксотрофности. Аллели ade1-14, lys2-87, thr4-B15 содержат нонсенс-мутацию UGA; аллель his7-1 несет нонсенс-мутацию UAA; leu2-1, met13-A1 - мутации, молекулярная природа которых неизвестна; ura3D - аллель гена URA3, несущая делецию этого гена; sup35-25 – рецессивная омнипотентная супрессорная мутация в гене SUP35.  * полное название этого штамма 25-25(-ду8-132-Л28)-2В-П3982. В работе использовалось его сокращённое название.

В работе использовали штамм Eсheriсhia coli XL1-Blue генотипа recA1 supE44 endA1 hsdR17 gyrA96 relA1 thi D(lac-proAB) F` [traD36 proAB⁺ lacI^q lacZDM15 Tn10(tet^r)]

Плазмиды.

Инсерционный банк генов получен из Йельского Центра по Анализу Генома (Burns et al. 1994). Этот банк состоит из бактериальных плазмид, несущих разные фрагменты хромосомной ДНК дрожжей, причём открытые рамки считывания, содержащиеся в этих участках, разрушены минитранспозоном mTn3 (рис. 1). Участок дрожжевой ДНК фланкирован сайтами рестрикции NotI. Банк разбит на 14 пулов.

Рисунок 1. Структура минитранспозона mTn-lacZ/LEU2.

LacZ – ген, кодирующий β-галактозидазу; LEU2 – дрожжевой ген LEU2; AmpR – ген устойчивости к ампицилину.

Плазмиду pRSQ2-URA3 использовали для интеграции в минитранспозон mTn3 бактериального ориджина репликации. Эта плазмида содержит дрожжевой ген URA3, бактериальный ген AmpR, бактериальный ориджин репликации, а так же фрагменты ДНК, гомологичные 5’ и 3’ концам гена LacZ (рисунок 2).

Рисунок 2. Физическая карта плазмиды pRSQ2-URA3.

LacZ 3’ и LacZ 5’  – участки, гомологичные 3’ и 5’ концу гена LacZ, соответственно; URA3 – дрожжевой ген URA3; AmpR – ген устойчивости к ампицилину.

Cреды и условия культивирования.

Для культивирования дрожжей использовали стандартные среды (Захаров и др., 1984; Sherman et al., 1986): полную среду YAPD, СПГ, минимальную среду MD, селективные среды на основе MD.

Для культивирования бактерий использовали среду LB (Sambrook et al., 1989). Селекцию устойчивых к ампицилину трансформантов проводили на среде LB с ампицилином в концентрации 100 мкг/мл.

Штаммы дрожжей выращивали при температуре 25^оС, штаммы бактерий - при 37^оС.

Генетические методы.

В работе использовали стандартные генетические методы, применяемые для дрожжей-сахаромицетов: тетрадный анализ, метод селективных сред для анализа ауксотрофности штаммов, метод отпечатков и т.д. (Захаров и др., 1984; Sherman et al., 1986).

Молекулярно-генетические методы.

Трансформацию дрожжей проводили по методу Гитца (Agatep et al., 1998). Клетки с твердой среды YAPD переносили в 5 мл жидкой среды YAPD и выращивали в течение ночи при 25^оС на качалке. Потом культуру разбавляли теплой YAPD до плотности клеток 5x10⁶ клеток в мл. Клетки выращивали в 50 мл среды продолжали на качалке с 170 об/мин при 25^оС до плотности около 2x10⁷ клеток в мл среды. Суспензию клеток переносили в пробирки и центрифугировали (5000 об/мин, 5 мин). Затем, вылив среду, клетки ресуспендировали в 25 мл воды и снова осаждали при тех же условиях. Далее ресуспендировали клетки в 1 мл 100 мМ раствора ацетата лития. Суспензию переносили в эппендорфовские пробирки. Клетки осаждали 15 сек при 8000 об/мин, и пипеткой удалили ацетат лития. Ресуспендировали клетки в 400 мкл 100мМ ацетата лития. Клеточную суспензию разливали по 50 мкл в эппендорфовские пробирки, осаждали клетки, и пипеткой удаляли ацетат лития. После этого к осадку добавляли трансформационную смесь в следующем порядке: 240 мкл 50% (в/об) полиэтиленгликоля (ПЭГ 4000), 36 мкл 1М ацетата лития, 50 мкл балластной ДНК (2 мг/мл), 34 мкл воды с плазмидной ДНК. Осадок тщательно ресуспендировали. Далее пробирки инкубировали при 25^оС в течение 30 минут. После этого клетки подвергали тепловому шоку (42^оС, 15 минут) и осаждали (8000 об/мин 1 минута). Затем удаляли трансформационную смесь, ресуспендировали клетки в 1 мл воды и высевали на чашки с селективной средой. Результаты трансформации учитывали на 6 день после высева.

Электропорация бактерий (Miller and Nickoloff, 1995). Трансформацию клеток E.coli осуществляли с методом электропорации. Для этого использовали электропоратор MicroPulser (Bio-Rad). Для приготовления компетентных клеток 5 мл свежей ночной культуры клеток E.coli переносили в 500мл LB и выращивали на качалке (170 об/мин) при   37 ^оС до оптической плотности OD₆₀₀ 0,7. Полученную суспензию клеток охлаждали в течении 20 мин в ледяной бане, после чего осаждали в охлажденной центрифуге (15мин при 4000 об/мин). Осадок ресуспендировали в 500 мл охлажденной до 4 ^оС воды, а затем осаждали при тех же условиях. Осадок снова ресуспендировали в 250 мл охлажденной воды и снова осаждали. Полученный осадок ресуспендировали в 20 мл охлажденного 10 % глицерина и снова осаждали. Осадок ресуспендировали в 1 мл охлажденного 10 % глицерина, затем расфасовывали по 40 мкл клеток в эппендорфовские пробирки и замораживали в жидком азоте. Компетентные клетки размораживали на льду и смешивали с 1-2 мкл ДНК. Инкубировали на льду 1-2 минуты и переносили в охлажденную кювету для электропорации (0,2 см). Через кювету пропускали ток (2,5 кВ, около 5 мс) и добавляли 1 мл среды SOC. Затем инкубировали клетки при сильном качании 1 час при 37 ^оС. Высевали клетки на твердую среду LB с ампицилином.

Выделение дрожжевой ДНК (Kaiser et. al., 1994). Клетки с твердой среды YAPD засевали в 40мл жидкой среды YAPD и выращивали в течение ночи при 25^оС на качалке. На следующий день выросшую культуру переносили в пробирки и откручивали в центрифуге 5 мин. при 6000об/мин.  Затем, вылив среду, клетки ресуспендировали в 3 мл раствора 1M сорбитола в 0,1M EDTA (pH 7,5) и добавляли 0,1 мл раствора зимолиазы в 0,1M EDTA (с концентрацией 20мг/мл). Полученную смесь инкубировали в 37^оС, время от времени помешивая. Через 60 мин суспензию клеток центрифугировали (5000 об.мин в течение 5 мин). Осадок ресуспендировали в 2,5 мл раствора 50 mM триса в 20 mM EDTA и добавляли 0,25 мл 10% SDS. После этого пробирки помещали в 65^оС. Через 30 мин в пробирки добавляли 750мкл 5М ацетата калия и инкубировали при 4 ^оС 60 мин. Затем пробирки центрифугировали в течение 10 мин при 10000 об/мин (4 ^оС). К супернатанту добавляли два объема охлажденного 96% спирта. ДНК осаждали 10 мин при 10000 об/мин при 4^оС. Затем осадок промывали 70% этанолом, высушивали и растворяли в 1,5 мл ТЕ с РНКазой (20 мкг/мл) и инкубировали в течение часа при 37^оС. После этого раствор ДНК экстрагировали одним объемом насыщенного фенола; хлороформом и смесью  фенола и хлороформа (1:1). Затем к раствору ДНК добавляли два объема 96% этанола, осаждали  10 мин при 10000 об/мин при 4^оС. Затем осадок промывали 70% этанолом, высушивали и растворяли в 200 мкл ТЕ.

Выделение плазмидной ДНК проводили по стандартной методике (Sambrook et al., 1989).

Рестрикция проводилась при 37 ^оС в течение 1-6ти часов. Приготовление рестрикционной смеси проводили в соответствии со стандартными пропорциями, исходя из концентрации           ДНК и используемой рестриктазы.  

Лигирование рестрицированной ДНК проводили в течение 16 часов при 16 ^оС. Для приготовления лигазной смеси к 2 мкг рестрицированной ДНК добавляли 215 мкл воды, 25мкл десятикратного лигазного буфера и 1 мкл лигазы (400 единиц).  

Секвинирование полученных в работе плазмид, проводила фирма Helix.  Для этого использовали праймер М13(-47): 5’ gccagggttttcccagtcacga 3’.

Гель-электрофорез рестрикционной смеси проводили в 0,5%-ном агарозном геле с буфером TBE при напряжении 5 V на см (Маниатис и др., 1984). В качестве маркера молекулярных весов использовали килобазную ДНК (Stratagene).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Трансформация штамма 25-25-2В-П3982 [ISP⁺] инсерционным банком генов.

Используемый нами метод клонирования детерминанта [ISP⁺] основан на трансформации инсерционным банком генов, при которой возможно разрушение гена [ISP ⁺] вставкой минитранспозона.

Инсерционный банк дрожжевых генов (Burns et al. 1994) был получен из Йельского Центра по Анализу Генома. Он представляет собой дрожжевую библиотеку генов, в которой каждая открытая рамка считывания разрушена вставкой минитранспозона mTn3 (см. "материалы и методы"). Инсерционный банк разбит на 14 пулов. В нашей работе мы использовали пулы №№ 21, 22, 24, 28, 31, 37.

Перед трансформацией плазмидная ДНК пулов была линеаризована. Для этого ДНК каждого пула (10 мкг) обрабатывали рестриктазой NotI (см. "материалы и методы"). Эта обработка приводит к тому, что выщепляется фрагмент дрожжевой ДНК, содержащий вставку транспозона из бактериальной части плазмиды, так как сайты рестрикции NotI находятся по краям дрожжевых фрагментов ДНК. Результаты рестрикции проверяли с помощью гель-электрофореза (см. "материалы и методы"). Для этого использовали 1/100 часть рестрикционной смеси. Как и предполагалось, во всех случаях на геле были видны две полосы: полоса, приблизительно соответствующая 2,1 т.п.о. (длина бактериальной части плазмиды), и размытая полоса в районе 8 т.п.о. (длина дрожжевой ДНК варьирует, но приблизительно соответствует 8 т.п.о.).

Линеаризованной ДНК каждого пула был трансформирован штамм 25-25-2В-П3982 (см. "материалы и методы"). Трансформационную смесь высевали на двадцать чашек с синтетической средой, не содержащей лейцин. На шестой день после высева производили подсчет полученных трансформантов.

В случае использования штаммов cir^-, т.е. не содержащих 2µ ДНК, для обеспечения 95% вероятности того, что каждая открытая рамка считывания дрожжевого генома дизруптирована минитранспозоном, необходимо получить по крайней мере 30000 трансформантов от трансформации каждым пулом инсерционного банка. Поскольку штамм 25-25-2В-П3982 является CIR⁺, вследствие чего возможно встраивание минитранспозона и в 2µ ДНК (примерно в 10% случаев) (Burns et al. 1994), количество анализируемых нами интегрантов каждого пула должно превышать 33000. В случае недостаточного количества полученных интегрантов проводили повторную транформацию.

В результате трансформации используемыми пулами было получено 252000 трансформантов (Таблица 2).

Таблица 2. Результаты анализа трансформантов.

№ пула инсерцион-ного банка	Кол-во получен-ных тр-тов	Из них первичноотобран-ных тр-тов	Из них тр-тов His+Lys+	Из них тр-тов, потерявших [ISP^+]	Из них гибридов, подвергнутых тетрадному анализу
№ 21	50 000	526	-	-	-
№ 22	45 000	432	269	33 (проверено 168)	-
№ 24	75 000	427	147 .	46	-
№ 28	28 000	60	52	25	5
№ 31	30 000	66	36	17	2
№ 37	24 000	50	33	13	9
Σ	252 000	1561	537	134	16

Идентификация и анализ трансформантов, потерявших детерминант [ISP⁺].

При анализе трансформантов контролировалось соответствие их фенотипов предполагаемому фенотипу штаммов с дизрупцией структурного гена детерминанта [ISP⁺]. Если дизрупция структурного гена не приводит к собственному фенотипическому эффекту, а ведет только к исчезновению [ISP⁺], то при разрушении минитранспозоном гена ISP, у интегрантов штамма 25-25-2В-П3982 должен проявиться эффект супрессии мутаций his7-1 и lys2-87, вызванный мутацией sup35-25, то есть такие интегранты должны стать прототрофными по гистидину и лизину.

Одновременную супрессию нонсенс-мутаций his7-1 и lys2-87 использовали для отбора интегрантов, потерявших детерминант [ISP⁺]. Для этого интегранты были перепечатаны на среду, не содержащую гистидин, лизин и лейцин, с которой на 5 день отбирались растущие на этой среде колонии трансформантов. Всего было отобрано 1561  интегрант (см. табл. 2).

Отобранные трансформанты всех пулов (кроме №21) были клонированы истощающим штрихом на среде YAPD, и отобрано по три клона. Эти клоны были проанализированы методом отпечатков на селективных средах, не содержащих аденин, гистидин, лизин и лейцин и на среде СПГ. Все клоны имели фенотип Leu+, что говорит о встраивании минитранспозона в геном каждого клона. Некоторые клоны были ауксотрофны по гистидину и/или лизину, что можно объяснить большим количеством трансформантов на исходных чашках, так что при отсеве вместе с клетками, растущими на среде, не содержащей гистидин и лизин, могли быть захвачены и клетки, не растущие на ней.  Для трансформантов пулом №21 была проведен только первичный отбор прототрофных по гистидину и лизину интегрантов (см. табл. 2).

Часть отобранных клонов была скрещена со штаммами 5Б-П4513 [ISP⁺] и 5Б-П4513 [isp^-] (см. "материалы и методы"). На следующий день после скрещивания гибриды были перепечатаны на селективную среду, не содержащую треонин и метионин. Выросшие гибриды были проанализированы методом отпечатков на селективных средах, одновременно не содержащих метионин и треонин, и гистидин или лизин.

Этот анализ позволяет отличить трансформантов, в которых произошла потеря [ISP⁺] в результате инсерции минитранспозона, от трансформантов, в которых произошли спонтанные доминантные мутации, приводящие к элиминации [ISP⁺], а также доминантные и рецессивные мутации, маскирующие проявление [ISP⁺]. В случае элиминации [ISP⁺] под воздействием вставки минитранспозона гибрид, полученный от скрещивания с [isp^-] штаммом будет иметь супрессорный, а от скрещивания с [ISP⁺] штаммом несупрессорный фенотип. В случае спонтанных доминантных мутаций, приводящих к супрессорному фенотипу, оба гибрида будут прототрофны по гистидину и лизину, а в случае рецессивной мутации, приводящих к супресорному фенотипу, но не элиминирующих детерминант [ISP⁺] (т.е. маскирующих его) в обоих гибридах будет проявляться [ISP⁺] и они будут иметь несупрессорный фенотип. Следует отметить, что разница в росте гибридов от скрещивания с [ISP⁺] и [isp^-] штаммом будет наблюдаться не только в случае элиминации [ISP⁺] из-за вставки минитранспозона, но и в случае спонтанной потери [ISP⁺], а также в случае спонтанных рецессивных мутаций, приводящих к его элиминации.

Таким образом, в дальнейшей работе использовали трансформанты, которые удовлетворяли следующим условиям:

· они были одновременно ауксотрофны по гистидину и лизину.

· гибриды, полученные от их скрещивания со штаммом 5Б-П4513 [isp^-], имели супрессорный фенотип.

· гибриды, полученные от скрещивания трансформантов с 5Б-П4513 [ISP⁺], не супрессировали мутации his7-1 и lys2-87.

Среди 369 проанализированных трансформантов этими свойствами обладали 134 трансформанта (см. табл. 2). В дальнейшей работе использовался один клон каждого трансформанта.

Для дальнейшего анализа трансформантов проводился тетрадный анализ их гибридов от скрещивания со штаммом 5Б-П4513 [ISP⁺]. Анализируемые диплоиды (sup35-25//sup35-25 his7-1//his7-1 lys2-87//lys2-87 ISP::mTn3//ISP [ISP⁺]) гомозиготны по мутации sup35-25 и по мутациям his7-1 и lys2-87, что позволяет учитывать расщепление по эффекту супрессии на средах, не содержащих гистидина и лизина. Если у трансформанта произошла дизрупция структурного гена детерминанта [ISP⁺], то две аскоспоры в тетраде, несущие дизрупцию ISP, теряют детерминант [ISP⁺], а две, несущие нормальный ген ISP, сохраняют детерминант [ISP⁺]. Таким образом в тетрадах гибрида от скрещивания трансформантов с дизрупцией гена ISP, и штамма 5Б-П4513 [ISP⁺], предполагается расщепление 2His+Lys+Leu+ : 2His-Lys-Leu-. В случае спонтанной рецессивной мутации, приводящей к элиминации [ISP⁺], расщепление по эффекту супрессии так же будет наблюдаться, однако оно не будет связано с наследованием инсерции транспозона. При спонтанной потере [ISP⁺] у исходных трансформантов, в тетрадном анализе не будет регулярного расщепления по эффекту супрессии.

Гибриды от скрещивания трансформантов, потерявших [ISP⁺], со штаммом 5Б-П4513 [ISP⁺] были отобраны с селективной среды и расклонированы истощающим штрихом на среде YAPD. Было отобрано по три клона каждого из гибридов. Они были проанализированы методом отпечатков на селективных средах, не содержащих аденин, гистидин, лизин, лейцин, метионин, треонин и на среде СПГ, а так же проверены на тип спаривания. Учет проводился на четвертый и шестой день. Все клоны по фенотипу соответствовали фенотипу гибридов. Все клоны со среды YAPD были пересеяны на предспоруляционную среду, а через четыре дня на среду для споруляции (см. «материалы и методы»).

Был проведен тетрадный анализ 16 гибридов (таблица 3). Сегреганты отсевались на среду YAPD на шестой-десятый день и анализировались методом отпечатков на средах, не содержащих аденин, гистидин, лизин, лейцин, метионин, треонин, СПГ, а так же проверялись на тип спаривания. Результаты роста на селективных средах учитывались на четвертый и шестой день. Истинность тетрад контролировалась по моногенному расщеплению по типу спаривания и по прототрофности по метионину и треонину. Следует отметить, что у всех проанализированных гибридов наблюдалось расщепление по лейцину 2:2, что говорит об единичной инсерции минитранспозона.

Таблица 3. Расщепление в тетрадах гибридов от скрещивания интегрантов, потерявших [ISP⁺], со штаммом 5Б-П4513 [ISP⁺].

Гибрид	Инте-грант	Всего тетрад	Количество тетрад с соотношением:
			2Sup^+Leu^-: 2Sup^-Leu^+	2Sup^-Leu^-: 2Sup^-Leu^+	2Sup^-Leu^-: 2Sup^+Leu^+	1Sup^+Leu^-: 1Sup^-Leu^+: 1Sup^-Leu^-: 1Sup^+Leu^+	2Sup^+Leu^-: 2Sup^+Leu^+
П4525	37.1	2+4*	-	-	2+3*	1*	-
П4526	37.2	3+5*	-	-	3+5*	-	-
П4532	37.3	6	-	-	6	-	-
П4551	37.4	11+2*	-	-	1+2*	10	-
П4552	37.5	3	-	-	1	2	-
П4553	37.6	5+2*	-	-	1+1*	4+1*	-
П4554	37.7	9+2*	1	-	4	4+2*	-
П4555	37.8	4+4*	1*	-	1*	3+3*	-
П4556	28.1	5+1*	-	-	4+1*	1	-
П4557	28.2	5+3*	-	-	5+3*	-	-
П4558	28.3	4+1*	-	-	-	4+1*	-
П4559	31.1	9	1	-	1	7	-
П4560	31.2	5+3*	1+1*	-	1+2*	3	-
П4561	28.4	4+1*	1	-	-	3+1*	-
П4562	28.5	2+2*	-	-	2*	2	-
П4563	37.9	3+1*	-	-	-	3+1*	-

* отмечены трехспоровые тетрады.

Тетрадный анализ шести гибридов показал, что существует связь между присутствием минитранспозона и потерей детерминанта [ISP⁺].

Тетрадный анализ гибрида П4525, полученный от скрещивания интегранта № 37.1 со штаммом 5Б-П4513 [ISP⁺], показал, что наблюдалось отклонение от нормального расщепления по эффекту супрессии 4Sup^-:0Sup⁺ в сторону прототрофных по гистидину и лизину аскоспор (3^- : 1⁺ и 2^- : 2⁺) (см. табл. 3). При этом ауксотрофные по лейцину аскоспоры (39) не росли на среде без гистидина и лизина, а из 23 аскоспор, несущих вставку минитранспозона (Leu+), 14 были одновременно прототрофны по гистидину и лизину, 4 были прототрофны по лизину и ауксотрофны по гистидину, 5 были ауксотрофны по обоим маркерам. Таким образом, очевидно, что только аскоспоры, несущие вставку минитранспозона теряют [ISP⁺], что, по всей видимости, говорит о том, что инсерция минитранспозона привела к разрушению гена, который влияет на стабильность наследования [ISP⁺].

Следует так же отметить, что сегреганты, несущие вставку минитранспозона, сильно отставали в росте: на шестой день после тетрадного анализа диаметр колоний этих сегрегантов составлял около 0,3 мм, в то время как колонии остальных сегрегантов были в диаметре около 2 мм.

В тетрадном анализе гибрида П4526, от скрещивания интегранта № 37.2 со штаммом 5Б-П4513 [ISP⁺], было получено 7 полных и 7 неполных тетрад. Во всех случаях расщепление по способности к росту на среде без гистидина соответствовало расщеплению по лейцину (2His+Leu+ : 2His-Leu-) (см. табл. 3). Прототрофные по лейцину аскоспоры также были прототрофны по лизину, однако  две ауксотрофные по лейцину аскоспоры были прототрофны по лизину, что, по всей видимости, можно объяснить нечетким проявлением [ISP⁺] на данном генотипическом фоне. Таким образом, во всех проанализированных случаях вставка минитранспозона у сегрегантов гибрида П4526 приводит к исчезновению детерминанта [ISP⁺], что позволяет предположить, что мы имеем дело либо с геном, который кодирует [ISP⁺] (искомым ген), либо мы получили дизрупцию гена, который не является структурным геном [ISP⁺], но участвует в контроле его поддержания.

В тетрадном анализе гибрида П4532, полученного от скрещивания интегранта № 37.3 со штаммом 5Б-П4513 [ISP⁺],  во всех тетрадах наблюдалось расщепление 2His+Leu+:2His-Leu- (см. табл. 3, рис. 2). Расщепление по способности роста на среде без лизина было нечетким. На четвертый день роста на селективных средах все прототрофные по лейцину аскоспоры были прототрофны по лизину, а все ауксотрофные по лейцину сегреганты были ауксотрофны и по лизину. Однако на шестой день некоторые сегреганты не несущие вставку минитранспозона стали прототрофны по лизину. Таким образом, можно предположить, что и в данном случае инсерция минитранспозона привела к разрушению либо структурного гена ISP, либо гена, контролирующего поддержание детерминанта [ISP⁺].

а	б
C-Leu	C-His

Рисунок 2. Расщепление по способности к росту на среде без лейцина (а) и гистидина (б) в потомстве гибрида П4532.

Тетрадный анализ двух гибридов П4556 и П4557, полученных от скрещивания интегрантов № 28.1 и №28.2 со штаммом 5Б-П4513 [ISP⁺], дал сходные результаты. В тетрадах этих гибридов  наблюдалось расщепления 2His+Lys+Leu+ : 2His-Lys-Leu-, что соответствует нашему предположению о разрушении минитранспозоном структурного гена ISP (см. табл. 3). Однако, также наблюдалось расщепление по способности роста на среде, не содержащей аденин: 2Ade+His+Lys+Leu+ : 2Ade-His-Lys-Leu-. То есть, сегреганты, содержащие инсерцию транспозона, росли на среде без аденина лучше, чем сегреганты без инсерции. Таким образом, учитывая тот факт, что присутствие детерминанта [ISP⁺] практически не влияет на эффективность супрессии мутации ade1-14, можно предположить, что инсерция транспозона приводит к собственному супрессорному эффекту. Это предположение в настоящий момент проверяется.

Идентификация точки инсерции минитранспозона mTn3.

Дальнейшая работа с интегрантами, у которых инсерция минитранспозона влияет на поддержание детерминанта [ISP⁺], предполагает идентификацию точки инсерции минитранспозона.

Для этого мы использовали вспомогательную плазмиду pRSQ2-URA3. Эта плазмида содержит бактериальный ориджин репликации и два участка, гомологичных 5’ и 3’ концам гена lacZ (рисунок  3а). Интеграция линеаризованной плазмиды в транспозон mTn3 благодаря гомологичной рекомбинации приводит к замещению части гена lacZ на последовательность плазмиды pRSQ2-URA3 (см. рис. 3в). Таким образом, в транспозон оказывается встроен бактериальный ориджин репликации.

Плазмида pRSQ2-URA3 была линеаризована с помощью рестриктазы BamHI, которая имеет один сайт рестрикции между фрагментами гена LacZ (см. рис. 3б). Прохождение рестрикции контролировалось гель-электрофорезом.

Линеаризованной плазмидой были трансформированы штаммы, содержащие инсерцию минитранспозона:

1) гибрид П4525, полученный от скрещивания интегранта № 37.1 со штаммом 5Б-П4513 [ISP⁺],

2) сегрегант 5В-П4526 гибрида П4526, полученного от скрещивания интегранта № 37.2 со штаммом 5Б-П4513 [ISP⁺],

3) сегрегант 2А-П4532, полученного из интегранта № 37.3 со штаммом 5Б-П4513 [ISP⁺].

Рисунок 3. Схема получения плазмид, содержащих последовательность, фланкирующую точку инсерции транспозона.

(а) –плазмида pRSQ2-URA3; (б) – линеаризация плазмиды pRAQ2-URA3 рестриктазой BamHI;  (в) интеграция плазмиды pRAQ2-URA3 в транспозон mTn3; (г) фрагмент транспозона, содержащий бактериальный ориджин и ген устойчивости к ампицилину, образующийся после рестрикции хромосомной ДНК рестриктазой HindIII; (д) этот же фрагмент, но после самолигирования.

Для каждой трансформации использовали по 2 мкг линеаризованной плазмиды. Трансформационную смесь высевали на синтетическую среду без урацила и лейцина. Трансформантов отбирали на 6-10 день. Несколько трансформантов (4-10) каждого штамма были расклонированы истощающим штрихом на среде YAPD, и отобрано по три клона. Клоны трансформантов были проанализированы методом отпечатков на селективных средах, не содержащих урацил, лейцин, лизин, гистидин, аденин и на среде СПГ. Они росли на   среде   без урацила, что говорит о встраивании фрагмента плазмиды pRSQ2-URA3 в ДНК дрожжей. По способности роста на других селективных средах,  трансформанты не отличались от исходных штаммов.

В дальнейшей работе было использовано по два интегранта, полученных при трансформации плазмидой pRSQ2-URA3 гибрида П4525 (1-П4525, 5-П4525) сегреганта 5В-П4526 (51-5В-П4526, 52-5В-П4526) и сегреганта 2Г-П4550 (2-2Г-П4550, 3-2Г-П4550). Из интегрантов выделяли тотальную ДНК. Количество выделенной ДНК оценивали с помощью гель-электрофореза. Затем эту ДНК обрабатывали рестриктазой HindIII. Прохождение рестрикции контролировалось электрофорезом.

Рестриктаза HindIII разрезает хромосомную ДНК дрожжей благодаря случайно распределенным по геному сайтам рестрикции. В транспозоне, включающем интегрированную последовательность плазмиды pRSQ2-URA3, также есть три сайта рестрикции HindIII (см. рис. 3д). Переваривание ДНК рестриктазой HindIII приводит к формированию фрагмента ДНК у которого 3’ конец образовался из-за разрезания сайта  HindIII находящегося в транспозоне, а 5’ конец появился из-за разрезания сайта рестрикции, находящегося во фланкирующей точку инсерции хромосомной ДНК (см. рис. 3г). Таким образом, в результате такой рестрикции будет образовываться фрагмент, который содержит ориджин репликации, ген устойчивости к ампицилину, часть гена LacZ, и фрагмент дрожжевой ДНК, фланкирующий с 5’ конца точку инсерции минитранспозона (см. рис. 3д).

Рестрицированную с помощью HindIII ДНК лигировали. При этом подбирались такие условия лигирования, что бы преимущественно происходило самолигирование фрагментов ДНК. Таким образом, мы расчитывали получить плазмиду, содержащую фрагмент дрожжевой ДНК, фланкирующий с 5’ конца точку инсерции минитранспозона, которая будет способна к репликации благодаря бактериальному ориджину репликации и гену устойчивости к ампицилину (см. рис. 3е).

Лигазной смесью был трансформирован штамм E. coli XL1-Blue. Трансформационную смесь высевали на среду LB с ампицилином. Для каждой пробы на среду LB с ампицилином отсевалось и в дальнейшем анализировалось по 24 трансформанта. Из трансформантов, полученных из ДНК штаммов 1-П4525, 5-П4525 и 51-5В-П4526, 52-5В-П4526, была выделена плазмидная ДНК и растворена в 20мкл ТЕ. Оценка концентрации выделенной ДНК производилась с помощью электрофореза, для которого было использовано по 2 мкл раствора ДНК. 

Была проведена проверка полученных плазмид. Для этого ДНК каждой плазмиды (0,3 мкг) обрабатывали одновременно рестриктазами BamHI и HindIII. Соответствующие сайты рестрикции фланкируют участок плазмиды pRSQ2-URA3, составляющий примерно 2,8 т.п.о., который должен присутствовать в полученных плазмидах. Результаты рестрикции контролировали с помощью электрофореза, при этом в качестве контроля использовали ДНК исходной плазмиды pRSQ2-URA3, так же обработанной рестриктазами BamHI и HindIII.

У всех плазмид, полученных из ДНК штаммов 1-П4525, 5-П4525 мы наблюдали бэнд, соответствующий 2,8 т.п.о. (рисунок 4). В качестве контроля полученные плазмиды обрабатывали одной рестриктазой BamHI (рисунок 5б) или HindIII (рисунок 5а). Для дальнейшей работы мы использовали по одной плазмиде, полученной от каждого штамма: p1 (2-я дорожка рис. 4) и p5 (6-дорожка рис. 4) от штаммов 1-П4525 и 5-П4525 соответственно. Обе плазмиды содержали участок ДНК длиною около 2,8 т.п.о., который вырезался при совместном действии рестриктаз BamHI и HindIII.

В случае штаммов 51-5В-П4526, 52-5В-П4526 фрагмент ДНК, соответствующий 2,8 т.п.о., не был обнаружен, что можно объяснить тем, что сайт рестрикции HindIII располагался далеко от места инсерции транспозона. Поэтому нами были повторно проведены все этапы получения плазмид. При этом рестриктаза HindIII была заменена на XhoI, которая так же как HindIII имеет сайты рестрикции в транспозоне (см. рис. 3в). В результате двойной рестрикции XhoI и BamHI вновь полученных плазмид вырезался фрагмент, соответствующий 2,8 т.п.о. (рисунок 6). Плазмиды были обозначены p51 и p52.

Рисунок 4. Электрофореграмма рестрикции рестриктазами BamHI и HindIII плазмид, полученных из ДНК штаммов 1-П4525, 5-П4525.

Плазмида pRSQ2-URA3 (дорожка 1); плазмиды, полученные из штаммов 1-П4525 (дорожки 2-5)  и 5-П4525 (дорожки 6-11); маркер молекулярного веса – килобазная ДНК (дорожка 12)

а	б

Рисунок 5. Электрофореграмма рестрикции рестриктазами HindIII (а) и BamHI (б) плазмид, полученных из ДНК штаммов 1-П4525, 5-П4525.

Маркер молекулярного веса – килобазная ДНК (дорожка 1 и 13); плазмида pRSQ2-URA3 (дорожка 2); плазмиды, полученные из штаммов 1-П4525 (дорожки 3-6)  и 5-П4525 (дорожки 7-12).

Рисунок 6. Электрофореграмма рестрикции рестриктазами XhoI и BamHI  плазмид p51 и p52.

Маркер молекулярного веса – килобазная ДНК (дорожка 1 и 8); плазмиды p51и p52, обработанные рестриктазой XhoI (дорожки 2 и 3, соответственно); плазмиды p51и p52, обработанные рестриктазой BamHI (дорожки 4 и 5, соответственно); плазмиды p51и p52, обработанные рестриктазами XhoI и BamHI (дорожки 7и 8, соответственно).

Секвенирование плазмид p1 и p5, и анализ полученных результатов.

Плазмиды  p1, p5, p51, p52 были секвенированы (см. «материалы и методы»). Для секвенирования использовали праймер М13(-47). Праймер расположен в 5’ конце гена LacZ и направлен в сторону фланкирующей транспозон дрожжевой ДНК (см. рис. 3е).

Нуклеотидные последовательности секвенированных участков плазмид p1 и p5 оказались идентичными. Поиск гомологичной последовательности в базе данных, содержащей нуклеотидную последовательность дрожжевого генома, с помощью программы BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) показал, что  секвенированный участок плазмиды  p1 с 1 по 62 нуклеотид идентичен 5’ концу транспозона, а с  63 по 1009 нуклеотид идентичен последовательности гена SFP1. Таким образом, инсерция транспозона в интегранте № 37.1 произошла в внутри гена SFP1  (рисунок 7).

Рисунок 7. Точка инсерции транспозона mTn3 в гене SFP1.

Белок, кодируемый геном SFP1, является транскрипционным фактором и участвует в регуляции нескольких клеточных процессов. Он контролирует экспрессию, по крайней мере, 60 генов, участвующих в биогенезе рибосом (Jorgensen et. al., 2002). Кроме того, Sfp1 контролирует переход из стадии G2 в M и участвует в   репарации ДНК (Xu and Norris, 1998). Показано, что дизрупция этого гена приводит к сильному замедлению роста дрожжевых клеток (Blumberg and Silver, 1991), что соответствует полученным нами результатам.

Тот факт, что Sfp1 является регулятором генов, участвующих в биогенезе рибосом, позволяет высказать предположение, что Sfp1 регулирует экспрессию структурного гена [ISP⁺]. Таким образом, дизрупция SFP1 приводит к пониженной экспрессии гена ISP и, соответственно, приводит к снижению стабильности детерминанта   [ISP⁺].  

С другой стороны, Sfp1 является глутамин (6%) и аспарагин (14%) богатым белком (рисунок 8) и входит в список предполагаемых прионных белков (Michelitsch and Weissman, 2000). Таким образом, Sfp1 сам может является структурным геном детерминанта [ISP⁺].

В настоящее время высказанные предположения проходят экспериментальную проверку.

1 MDFTTMTMAS NMATSTTTTA TSAHASINSS SNFNIDIDSN QNTPSILINN

   51 NSDSSNGKNT DFNGVNNIHQ KNIMNNTNNV HLYSPNIMDQ TLLTPQDIAK

101 LRRESIAHSQ GMGGVSWGSI SVGSWLRDEI ISRRNSIVPA SANGAASAAA

  151 SATTTATNTL QIQQPTKRPS VSNPPYHRGY SISPQIAYTA YLPNLEKQYC

  201 KDYSCCGLSL PGLHDLLRHY EEAHISTSPN TTNMSQIPMN SAGNTSSSVR

  251 MTNNTSSANY NLQNNMAANT KNAGHKTNTM QAHSSNATNN TSINNMHANL

  301 QSNMDSNSTI RQSQHPHHQQ NIIQQQLQSN SVNHTSGAVP TPSVMGSATA

  351 SSTTANPNVI SITGAPNSGL SMANHSQQLH LNGNLVDAVS TNDVFLRTSN

  401 SPSRHVPHNK QINSNNNSGI NINNNTSHNS NINMGSKNAM VNRPHTFNNY

  451 SLNKTSRNPI QHQSRKIDPH QTDLSPLVLV QDIDLSFMDD DILGPSNHNS

  501 MNSVVNPTTG SHNYNTFHSS VHAKSSQNMV EDQDIDDIDD DDDVDDDDDD

  551 DDDDDTENGS SSNGKSVHNN NYKMPQQAYI DDPARRLYVM DHEEQKPFKC

  601 PVIGCEKTYK NQNGLKYHRL HGHQNQKLHE NPDGTFSVID PDSTDSFGDG

  651 MGSAKDKPYR CEVCGKRYKN LNGLKYHRGH STH

Рисунок 8.  Первичная структура белка Sfp1.

Жирным шрифтом выделены последовательности, обогащенные глутамином и аспарагином

Секвенирование плазмид p51 и p52, и  анализ полученных результатов.

Нуклеотидные последовательности секвенированных участков плазмид p51 и p52 также оказались идентичными. Поиск гомологии в базе данных дрожжевого генома показал, что с 1 по 64 нуклеотид последовательность секвенированного участка плазмиды p51 идентична  5’ концу транспозона, а с 65 по 1004 нуклеотид идентична последовательности гена  UPF1 (NAM7). Таким образом, инсерция транспозона в интегранте 37.2 произошла внутри гена UPF1  (рисунок 9).

Рисунок 9. Точка инсерции транспозона mTn3 в гене UPF1.

Белок Upf1 является одним из компонентов системы деградации нонсенс содержащих РНК. Эта система защищает клетку от появления большого количества аберрантных белков, синтезируемых с РНК матриц, содержащих преждевременные стоп кодоны (Hilleren and Parker, 1999). Белок Upf1 принадлежит семействе ДНК/РНК зависимых геликаз и в своем составе содержит ДНК/РНК связывающий домен и ДНК/РНК зависимую АТФазу. Следует отметить, что не содержит большого количества глутамина и аспарагина в своем составе и, следовательно, не является прионным белком.

Белок Upf1 взаимодействует с белками Upf2 и Upf3, также являющимися компонентами системы деградации нонсенс содержащих РНК (Hilleren and Parker, 1999). Кроме того, Upf1 взаимодействует с факторами терминации Sup35 и Sup45. Показано, что делеция UPF1 приводит к накоплению нонсенс-содержащих РНК и к нонсенс-супрессии (Czaplinski et. al., 1998). По всей видимости, Upf1 выполняет две функции: участвует в деградации нонсенс-содержащих РНК, а также участвует в регуляции терминации (He and Jacobson, 2001).

Полученные нами данные противоречат тому, что известно о гене UPF1. Так, показано, что мутации по этому гену дизрупция этого гена приводит к нонсенс-супрессии, однако интегрант № 37.2, а также сегреганты гибрида П4526, несущие инсерцию транспозона, по своему фенотипу не отличаются исходного [isp^-] штамма. Штамм 25-25-2В-П3990 [isp^-], несущий мутацию sup35-25, супрессирует нонсенс мутации ade1-14, his7-1 и lys2-87. У интегранта  № 37.2 и его потомков, несущих дизрупцию UPF1, не было отмечено усиление супрессии ни одного из этих генов. Этот факт можно объяснить тем, что при инсерции транспозона произошла дизрупция гена UPF1, однако, не был потерян детерминант [ISP⁺]. Таким образом, супрессорный эффект мутации sup35-25 компенсировался детерминантом [ISP⁺], а наблюдаемая нами супрессия была вызвана дизрупцией UPF1, то есть дизрупция UPF1 маскировала антисупрессорный эффект [ISP⁺].  В то же время следует отметить, что мы не обнаружили [ISP⁺] у интегрант № 37.2.  Таким образом, вопрос о влиянии дизрупции гена UPF1 на детерминант [ISP⁺] остается открытым и в настоящее время исследуется.

Выводы.

1 Проведен частичный скрининг инсерционного банка генов дрожжей, направленный на выявление структурного гена прионоподобного детерминанта [ISP⁺], а также генов, от которых зависит его поддержание и проявление.

2 Выявлено 537 интегрантов штамма 25-25-2В-П3982 [ISP⁺], у которых произошло изменение фенотипа c [ISP⁺] на [isp^-].

3 Генетический анализ 16 интегрантов, проведенный к настоящему времени, выявил 5 штаммов, у которых изменение фенотипа обусловлено инсерцией транспозона.

4 Проведен молекулярно-генетический анализ двух интегрантов. Показано, что элиминация (или маскировка проявления) детерминанта [ISP⁺] в одном случае обусловлена дизрупцией гена SFP1, в другом – гена UPF1.

список литературы.

1. Захаров И.А., Кожин С.А., Кожина Т.Н., Федорова И.В. Сборник методик по генетике дрожжей-сахаромицетов. Л.: Наука,  1984. - 143с

2. Кушниров В.В., Тер-Аванесян М.Д., Смирнов В.Н. Структурное и функциональное сходство белков Sup35p и Ure2p дрожжей и прионов млекопитающих // Молекулярная биология. - 1995. - V.29. - P.750-755.

3. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир,  1984.

4. Тиходеев О.Н., Гетманова Е.В., Тихомирова В.Л., Инге-Вечтомов С.Г. Неоднозначность трансляции у дрожжей: генетический контроль и модификации. В кн.: Молекулярные механизмы генетических процессов. М., 1990. - С. 218-228.

5. Agatep R., Kirkpatrick R.D., Parchaliuk D.L., Woods R.A., Gietz R.D. (1998) Transformation of Saccharomyces cerevisiae by the lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol (LiAc/ss-DNA/PEG) protocol. Technical tips online (http://tto.trends.com).

6. Aigle M., Lacroute F. Genetical aspects of [URE3], a non-Mendelian cytoplasmically inherited mutation in yeast // Mol. Gen. Genet. - 1975. - V.136. - P.327-335.

7. Bailleul P.A., Newnam G.P., Steenbergen J.N., Chernoff Y.O. Genetic study of interactions between the cytoskeletal assembly protein sla1 and prion forming domain of the release factor Sup35 (eRF3) in Saccharomyces cerevisiae // Genetics – 1999. –V.153. – P.81-94.

8. Blumberg H, Silver P. A split zinc-finger protein is required for normal yeast growth // Gene - 1991 -107(1) -101-10.

9. Burns N., Grimwade B., Ross-Macdonald P.B., Choi E.-Y., Finberg K., Roeder G.S., Snyder M. Large-scale characterization of gene expression, protein localization and gene disruption in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 8. - 1994. - P. 1087-1105.

10. Czaplinski K, Ruiz-Echevarria MJ, Paushkin SV, Han X, Weng Y, Perlick HA, Dietz HC, Ter-Avanesyan MD, Peltz SW. The surveillance complex interacts with the translation release factors to enhance termination and degrade aberrant mRNAs // Genes Dev. - 1998 - 12(11) - 1665-77.

11. Chernoff Y.O. Mutation processes at the protein level: is Lamarck back? // Mutation research. – 2001. – 488. P.39-64.

12. Chernoff Y.O., Derkach I.L., Inge-Vechtomov S.G. Multicopy SUP35 gene induces de novo appearance of psi-like factors in the yeast Saccharomyces cerevisiae // Curr.Genet. - 1993. - V.24. - P.268-270.

13. Chernoff Y.O., Lindquist S.L., Ono B., Inge-Vechtomov S.G., Liebman S.W. Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi⁺] // Science. - 1995. - V.268. - P.880-884.

14. Chernoff Y.O., Newnam G.P., Kumar J., Allen K., Zink A.D. Evidence for a protein mutator in yeast: role of the Hsp70-related chaperone ssb in formation, stability, and toxicity of the [PSI] prion // Mol.Cell Biol. - 1999. - V.19. - P.8103-8112.

15. Cox B.S. [PSI⁺], a cytoplasmic supperssor of supersuppressors in yeast // Heredity. - 1965. - V. 20. - P. 505-521.

16. Cox B.S. A recessive lethal super-suppressor mutation in yeast and other psi phenomena // Heredity. - 1971. - V.26. - P.211-232

17. Cox B.S. Psi, a cytoplasmic supperssor of supersuppressors in yeast // Heredity. - 192. - V.20. - P. 505-521.

18. Cox B.S., Tuite M.F., McLaughlin C.S. The psi factor of yeast: a problem in inheritance // Yeast. - 1988. - V.4. - P.159-178.

19. Cox B.S., Tuite M.F., Mundy C.J. Reversion from suppression to nonsuppression in SUQ5 [psi⁺] strains of yeast: the classificaion of mutations // Genetics. - 1980. - V.95. - P.589-609.

20. DePace A.H., Santoso A., Hillner P., Weissman J.S. A critical role for amino-terminal glutamine/asparagine repeats in the formation and propagation of a yeast prion // Cell - 1998. - V.93. - P.1241-1252.

21. Derkatch IL, Bradley ME, Masse SV, Zadorsky SP, Polozkov GV, Inge-Vechtomov SG, Liebman SW. Dependence and independence of [PSI(+)] and [PIN(+)]: a two-prion system in yeast? //EMBO J. - 2000  - 2;19(9) - 1942-52.

22. Derkatch I.L., Bradley M., Liebman S.W. Overexpression of the SUP45 gene encoding a Sup35-binding protein inhibits the induction of the de novo appearance of the [PSI⁺] prion // Proc.Natl.Acad. Sci. U.S.A. – 1998.- V.95. – P.2400-2405.

23. Derkatch I.L., Bradley M.E., Hong J.Y., Liebman S.W. Prions affect the appearance of other prions: the story of [PIN⁺] // Cell. - 2001. - V. 106. - P. 171-182.

24. Derkatch I.L., Chernoff Y.O., Kushnirov V.V., Inge-Vechtomov S.G., Liebman S.W. Genesis and variability of [PSI] prion factors in Saccharomyces cerevisiae // Genetics. - 1996. - V.144. - P.1375-1386.

25. Doel S.M., McCready S.J., Nierras C.R., Cox B.S. The dominant PNM2- mutation which eliminates the psi factor of Saccharomyces cerevisiae is the result of a missense mutation in the SUP35 gene // Genetics. - 1994. - V.137. - P.659-670.

26. Eaglestone S.S., Ruddock L.W., Cox B.S., Tuite M.F. Guanidine hydrochloride blocks a critical step in the propagation of the prion-like determinant [PSI⁺] of Saccharomyces cerevisiae // Proc.Natl.Acad.Sci.USA.. - 2000. - V.97. - P.240-244.

27. Edskes H.K., Wickner R.B. A protein required for prion generation: [URE3] induction requires the Ras-regulated Mks1 protein // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. - 2000. - V.97. - P.6625-6629.

28. Edskes, H.K.,. Gray V.T,. Wickner R.B. The [URE3] prion is an aggregated form of Ure2p that can be cured by overexpression of Ure2p fragments // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. - 1999. - V.96. - P.1498-1503.

29. Fernandez-Bellot E., Guillemet E., Baudin-Baillieu A., Gaumer S., Komar A.A., Cullin C. Characterization of the interaction domains of Ure2p, a prion-like protein of yeast // Biochem.J. - 1999. - V.338. - P.403-407.

30. Fernandez-Bellot E., Guillemet E., Cullin C. The yeast prion [URE3] can be greatly induced by a functional mutated URE2 allele // EMBO J. - 2000. - V.19. - P.3215-3222.

31. Gajdusek D.C. Transmissible and non-transmissible amyloidoses: autocatalytic post- translational conversion of host precursor proteins to beta-pleated sheet configurations // J.Neuroimmunol. - 1988. - V.20. - P.95-110.

32. Garvik B., Haber J.E. New cytoplasmic genetic element that controls 20S RNA synthesis during sporulation in yeast // J.Bacteriol. - 1978. - V.134. - P.261-269.

33. Glover J.R., Kowal A.S., Schirmer E.C., Patino M.M., Liu J.J., Lindquist S. Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of [PSI⁺], a heritable prion-like factor of S. cerevisiae // Cell. - 1997. - V.89. - P.811-819.

34. Glover J.R., Lindquist S. Hsp104, Hsp70 and Hsp40: a novel shaperone system that rescues previously aggregated proteins // Cell – 1998. – V.94. – P.1-20.

35. Griffith J.S. Self-replication and scrapie // Nature. - 1967. - V. 215. - P. 1043-1044.

36. He F, Jacobson A. Upf1p, Nmd2p, and Upf3p regulate the decapping and exonucleolytic degradation of both nonsense-containing mRNAs and wild-type mRNAs // Mol Cell Biol. - 2001 - 21(5) - 1515-30.

37. Hilleren P, Parker R. mRNA surveillance in eukaryotes: kinetic proofreading of proper translation termination as assessed by mRNP domain organization? // RNA. - 1999 - 5(6) - 711-9.

38. Holtzman D.A., Yang S., Drubin D.G. Synthetic-lethal interactions identify two novel genes, SLA1 and SLA2, that control membrane cytoskeleton assembly in Saccharomyces cerevisiae // J.Cell Biol. - 1993. - V.122. - P.635-644.

39. Jorgensen P, Nishikawa JL, Breitkreutz BJ, Tyers M. Systematic identification of pathways that couple cell growth and division in yeast // Science. - 2002 - 297(5580) - 395-400.

40. Kaiser C., Michaelis S., Mitchell A. Methods in yeast genetics. // Cold Spring Harbor Laboratory Press. – 1994.

41. King C.Y., Tittmann P., Gross H., Gebert R., Aebi M., Wuthrich K. Prion-inducing domain 2-114 of yeast Sup35 protein transforms in vitro into amyloid-like filaments // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. - 1997. - V.94. - P.6618-6622.

42. Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D. Structure and replication of yeast prions // Cell. - 1998. - V.94. - P.13-16.

43. Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D., Telckov M.V., Surguchov A.P., Smirnov V.N., Inge-Vechtomov S.G. Nucleotide sequence of the SUP2 (SUP35) gene of Saccharomyces cerevisiae // Gene. - 1988. - V.66. - P.45-54.

44. Lacroute F. Non-Mendelian mutation allowing ureidosuccinic acid uptake in yeast // J.Bacteriol. - 1971. - V.106. - P.519-522.

45. Liebman S.W., Derkatch I.L. The yeast [PSI⁺] prion: making sense of nonsense // J.Biol.Chem. - 1999. - V.274. - P.1181-1184.

46. Liebman S.W., Sherman F. Extrachromosomal psi⁺ determinant suppresses nonsense mutations in yeast // J.Bacteriol. - 1979. - V.139. - P.1068-1071.

47. Lindquist S., Patino M.M., Chernoff Y.O., Kowal A.S., Singer M.A., Lee K.-H., Blake T., Liedman S.W. The role of Hsp104 in stress tolerance and [PSI⁺] propagation in Saccharomyces cerevisiae // Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.  – 1995. – V.60. –P.451-460/

48. Liu J.J., Lindquist S. Oligopeptide-repeat expansions modulate 'protein-only' inheritance in yeast // Nature. - 1999. - V.400. - P.573-576.

49. Lund P.M., Cox B.S. Reversion analysis of [psi^-] mutations in Saccharomyces cerevisiae // Genet.Res. - 1981. - V.37. - P.173-182.

50. Maddelein M.L., Wickner R.B. Two prion-inducing regions of Ure2p are nonoverlapping // Mol.Cell Biol. - 1999. - V.19. - P.4516-4524.

51. Masison D.C., Maddelein M.L., Wickner R.B. The prion model for [URE3] of yeast: spontaneous generation and requirements for propagation // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. - 1997. - V.94. - P.12503-12508

52. Masison D.C., Wickner R.B. Prion-inducing domain of yeast Ure2p and protease resistance of Ure2p in prion-containing cells // Science. - 1995. - V.270. - P.93-95.

53. McReady S.J., McLaughlin C.S. A comparison of small circular DNA molecules in psi⁺ and psi^- strains of Saccharomyces cerevisiae // Biochim.Biophys.Acta. - 1977. - V.479. - P.119-121.

54. McReady S.J., Cox B.S. Antisuppressors in yeast // Mol.Gen.Genet. – 1973 – V.124. – P.305-320.

55. Michelitsch M.D., Weissman J.S. A census of glutamine/asparagine-rich regions: implications for their conserved function and the prediction of novel prions // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. - 2000. - V. 97. - P. 11910-11915.

56. Miller E.M., Nickoloff J.A. Escherichia coli electrotransformation // Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ. – 1995. – p. 105.

57. Oesch B., Westaway D., Walchli M., McKinley M.P., Kent S.B., Aebersold R., Barry R.A., Tempst P., Teplow D.B., Hood L.E. A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein // Cell. - 1985. - V.40. - P.735-746.

58. Pan K.M., Baldwin M., Nguyen J., Gasset M., Serban A., Groth D., Mehlhorn I., Huang Z., Fletterick R.J., Cohen F.E. Conversion of alpha-helices into beta-sheets features in the formation of the scrapie prion proteins // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. - 1993. - V.90. - P.10962-10966.

59. Patino M.M., Liu J.J., Glover J.R., Lindquist S. Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast // Science. - 1996. - V.273. - P.622-626.

60. Paushkin S.V., Kushnirov V.V., Smirnov V.N., Ter-Avanesyan M.D. In vitro propagation of the prion-like state of yeast Sup35 protein // Science. - 1997a. - V.277. - P.381-383.

61. Paushkin S.V., Kushnirov V.V., Smirnov V.N., Ter-Avanesyan M.D. Interaction between yeast Sup45p (eRF1) and Sup35p (eRF3) polypeptide chain release factors: implications for prion- dependent regulation // Mol.Cell Biol. - 1997b. - V.17. - P.2798-2805.

62. Paushkin S.V., Kushnirov V.V., Smirnov V.N., Ter-Avanesyan M.D. Propagation of the yeast prion-like [psi⁺] determinant is mediated by oligomerization of the SUP35-encoded polypeptide chain release factor // EMBO J. - 1996. - V.15. - P.3127-3134.

63. Prusiner S.B. Inherited prion diseases // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. - 1994. - V. 91. - P. 4611-4614.

64. Prusiner S.B. Molecular biology and pathogenesis of prion diseases // Trends.Biochem.Sci. - 1996. - V.21. - P.482-487.

65. Prusiner S.B. Molecular biology of prion diseases // Science. - 1991. - V.252. - P.1515-1522.

66. Prusiner S.B. Scrapie prions // Annu.Rev.Microbiol. - 1989. - V.43. - P.345-374.

67. Prusiner S.B., Scott M.R. Genetics of prions // Annu. Rev. Genet. - 1997. - V. 31. - P. 139-175.

68. Prusiner S.B., Scott M.R., DeArmond S.J., Cohen F.E. Prion protein biology // Cell. - 1998. - V. 93. - P. 337-348.

69. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T., Molecular cloning: a laboratory manual. – New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. – 723 p.

70. Sanchez Y., Taulien J., Borkovich K.A., Lindquist S. Hsp104 is required for tolerance to many forms of stress // EMBO J. - 1992. - V.11. - P.2357-2364.

71. Santoso A., Chien P., Osherovich L.Z., Weissman J.S. Molecular basis of a yeast prion species barrier // Cell. - 2000. - V.100. - P.277-288.

72. Sherman F., Fink G.R., Hincks J.B. Methods in yeast genetics. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,  1986. - 367 p.

73. Sondheimer N., Lindquist S. Rnq1: an epigenetic modifier of protein function in yeast // Mol.Cell - 2000. - V.5. - P.163-172.

74. Stansfield I., Jones K.M., Kushnirov V.V., Dagkesamanskaya A.R., Poznyakovski A.I., Paushkin S.V., Nierras C.R., Cox B.S., Ter-Avanesyan M.D., Tuite M.F. The products of the SUP45 (eRF1) and SUP35 genes interact to mediate translation termination in Saccharomyces cerevisiae // EMBO J. - 1995. - V.14. - P.4365-4373.

75. Taylor K.L., Cheng N., Williams R.W., Steven A.C., Wickner R.B. Prion domain initiation of amyloid formation in vitro from native Ure2p // Science. - 1999. - V.283. - P.1339-1343.

76. Ter-Avanesyan M.D., Dagkesamanskaya A.R., Kushnirov V.V., Smirnov V.N. The SUP35 omnipotent suppressor gene is involved in the maintenance of the non-Mendelian determinant [psi⁺] in the yeast Saccharomyces cerevisiae // Genetics. - 1994. - V.137. - P.671-676.

77. Ter-Avanesyan M.D., Kushnirov V.V., Dagkesamanskaya A.R., Didichenko S.A., Chernoff Y.O., Inge-Vechtomov S.G., Smirnov V.N. Deletion analysis of the SUP35 gene of the yeast Saccharomyces cerevisiae reveals two non-overlapping functional regions in the encoded protein // Mol.Microbiol. - 1993. - V.7. - P.683-692.

78. Tuite M.F., Lund P.M., Futcher A.B., Dobson M.J., Cox B.S., McLaughlin C.S. Relationship of the [psi] factor with other plasmids of Saccharomyces cerevisiae // Plasmid. - 1982. - V.8. - P.103-111.

79. Tuite M.F., Mundy C.R., Cox B.S. Agents that cause a high frequency of genetic change from [PSI⁺] to [psi^-] in Saccharomyces cerevisiae // Genetics. - 1981. - V. 98. - P. 691-711.

80. Volkov K.V., Aksenova A.Y., Soom M.J., Osipov K.V., Svitin A.V., Kurischko C., Shkundina I.S., Ter-Avanesyan M.D., Inge-Vechtomov S.G., Mironova L.N. Novel non-mendelian determinant involved in the control of translation accuracy in Saccharomyces cerevisiae // Genetics. - 2002. - V. 160. - P. 25-36.

81. Werner-Washburne M., Stone D.E., Craig E.A. Complex interacting among members of an essential subfamily of hsp70 genes in Saccharomyces cerevisiae // Mol.Cell Biol. - 1987. - V.7. - P.2568-2577.

82. Wickner R.B. [URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae // Science. - 1994. - V.264. - P.566-569.

83. Wickner R.B. Prions of yeast and heat-shock protein 104: 'coprion' and cure // Trends Microbiol. - 1995. - V.3. - P.367-369.

84. Wickner R.B., Masison D.C., Edskes H.K., Maddelein M.L. Prions of yeast, [PSI] and [URE3], as models for neurodegenerative diseases // Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol. - 1996. - V.61. - P.541-550.

85. Young C.S., Cox B.S. Extrachromosomal elements in a super-suppression system of yeast. II. Relations with other extrachromosomal elements // Heredity. - 1972. - V.28. - P.189-199.

86. Young C.S., Cox B.S. Extrachromosomal elements in a super-suppression system of yeast. I. A nuclear genes controlling the inheritance of extrachromosomal elements // Heredity. - 1971. - V.26. - P.413-422.

87. Xu Z, Norris D. The SFP1 gene product of Saccharomyces cerevisiae regulates G2/M transitions during the mitotic cell cycle and DNA-damage response // Genetics. - 1998 - 150(4) - 1419-28.